1、環境要清潔，進行無菌操作前半小時，須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動，防止塵埃飛揚。治療室應每天用紫外線消毒一次。
2、進行無菌操作時，衣帽穿戴要整潔。帽子要把全部頭發遮蓋，口罩須遮住口鼻，并修剪指甲、洗手。
3、無菌物品與非無菌物品應分別放置。無菌物品不可暴露在空氣中，必須放于無菌包或無菌容器內，無菌物品一經使用后，必須再經滅菌處理后方可使用。從無菌容器中取出的無菌物品，雖未使用，也不可放回無菌容器內。
4、無菌包應注明物品的名稱、消毒滅菌日期，并按日期先后順序排放，以便取用，放在固定的地方。無菌包在未污染的情況下，可保存7-14天，過期應重新滅菌。 5、取無菌物品時，必須用無菌持物鉗（鑷）。未經消毒的用物不可觸及無菌物或跨越無菌區。
6、進行無菌操作時，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，應更換或重新滅菌。
7、一份無菌物品，只能供一個病員使用，以免發生交叉感染。 無菌操作注意事項：
1. 實驗進行前，無菌室及
無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟
無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每 次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間 污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間 隔應讓
無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦 拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操 作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用， 盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病
毒
感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(**少Class II)。操作過程 中，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300 小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水 植物外植體消毒和接種：
用于進行組織培養的組織、器官和細胞稱為外植體。在組織培養中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進行表面消毒，這是取得培養成功的**基本的和重要的前提。常用消毒劑對外植體進行消毒。從室外取的材料，一般先用自來水沖洗數分鐘，對表面不光滑或長有絨毛等結構不容易洗凈的材料，自來水沖洗的時間要長，幾個小時或過夜，并且用洗衣粉或洗潔精洗滌，必要時用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后，要用無菌水洗滌3～5 遍，**后用無菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達到消毒目的，又不能損傷植物組織和細胞，還要符合就地取材的原則。對一些容易污染、較難滅菌的外植體進行表面消毒時，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般，shou先用75％乙醇浸泡外植體數秒鐘**30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無菌水洗滌。有時在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后，用無菌水洗，進一步剝去幾層組織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無菌水漂洗3 次后，切割、用于接種。
用消毒劑對接種材料進行滅菌處理時，可以在滅菌溶液中加入1～2 滴表面活性劑，如吐溫80或吐溫20，它們可以濕潤外植體整個組織，促進滅菌液充分接觸表面組織，達到較好的消毒效果。有時還可以用磁力攪拌、超聲振動等方法使消毒殺菌劑進入外植體。消毒溶液對外植體消毒是在
超凈工作臺上進行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養基中。
植物外植體消毒和接種(以胡蘿卜為例)：
1 ．接種前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴銨溶液擦拭
超凈工作臺臺面，將培養基及用具放入工作臺，開
超凈工作臺紫外燈照射**少20 min，然后開送風開關，之后關閉紫外燈，通風10 min后，再開日光燈進行無菌操作。
2 ．將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織，切成小塊分別放100 mL 燒杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡2 、5 、10 min ，用無菌水洗滌3 次，無菌紙吸干水分。取出培養皿，剪刀和鑷子使用前插入90％乙醇溶液中，使用鑷子時在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后，切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在試管口靠近火焰旁。#p#分頁標題#e#3 ．將培養容器斜面向上，并使它們拉于水平位置，也可將培養容器放在左手中。將塞蓋用右手擰轉松動，以便接種時拔出。用火焰灼燒管口，灼燒時應不斷轉動試管口（靠手腕的動作，使試管口沾染的少量菌得以燒死）。將燒過的接種針（環）觸動培養基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后輕輕接觸外植體，慢慢將接種針（環）抽出試管，打開培養容器蓋，將外植體放在培養基上，每瓶放3 塊。封口，貼標簽，注明姓名，標明時間和材料名稱。整理好接種室（箱）的臺面，搞好清潔衛生。
4 ．用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片，用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯中，在超凈工作臺上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用無菌水洗滌3 次，將葉片切成長1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養基上。
5 ．綠豆種子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐溫2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期間不斷攪拌溶液，用無菌水洗滌5～6 遍，洗干種子外圍水分，按照上述同樣的步驟接種于培養基上。
無菌操作原則：
一、在執行無菌操作時，必須明確物品的無菌區和非無菌區。
二、執行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環境清潔。 三、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。 [無菌操作間]
無菌操作間
四、進行無菌操作時，凡未經消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應分別放置。無菌包一經打開即不能視為**無菌，應盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回無菌容器內。
六、無菌包應按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。
七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時碰在容器外面被污染。
原則及注意事項
無菌操作原則：
一、在執行無菌操作時，必須明確物品的無菌區和非無菌區。 二、執行無菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環境清潔。 三、夾取無菌物品必須使用無菌持物鉗。
無菌操作間
四、進行無菌操作時，凡未經消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應分別放置。無菌包一經打開即不能視為**無菌，應盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回無菌容器內。 六、無菌包應按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經常檢查無菌包或容器是否過期，其中用物是否適量。 七、無菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過滿，以免取用時碰在容器外面被污染。
無菌操作技術及注意事項
1、玻璃器皿的消毒和清潔 ⑴新購玻璃器皿的處理新購玻璃器皿應用熱肥皂水洗刷，流水沖洗，再用1%～2%鹽酸溶液浸泡，以除去游離堿，再用水沖洗。對容量較大的器皿如試劑瓶、燒瓶或量具等，經清水洗凈后應注入濃鹽酸少許，慢慢轉動，使鹽酸布滿容器內壁數分鐘后傾出鹽酸，再用水沖洗。 ⑵污染玻璃器皿的處理 ①一般試管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分鐘，或在3%～5%漂白粉澄清液內4小時，有的亦可用肥皂或合成洗滌劑洗刷使盡量產生泡沫，然后用清水沖洗**無肥皂為止。**后用少量蒸餾水沖洗。 ②細菌培養用的試管和培養皿可先行集中，用1kg/cm2高壓滅菌15～30分鐘，再用熱水洗滌后，用肥皂洗刷，流水沖洗。 ③吸管使用后應集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小時，逐支用流水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗。 ④油蠟沾污的器皿，應單獨滅菌洗滌，先將沾有油污的物質棄去，倒置于吸水紙上，100℃烘干半小時，再用堿水煮沸，肥皂洗滌，流水沖洗。必要時可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水沖洗，后用清潔或稀鹽酸洗脫染料，再用清水沖洗。一般染色劑呈堿性，所以不宜用肥皂的堿水洗滌。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水沖洗，再用肥皂或弱堿性煮沸，自然冷卻后，流水沖洗。被結核桿菌污染或不易洗凈的玻片，可置于清潔液內浸泡后再沖洗。 2、無菌器材和液體的準備將玻璃器具中的培養皿、培養瓶、試管、吸管等按上述方法洗凈烘干后，用一潔凈紙包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，裝入干凈的鋁盒或鐵盒中，于120℃的干燥箱中干燥滅菌2小時，取出備用。對于手術器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，則采用高壓蒸氣滅菌法，即在15磅的條件下，加熱20分鐘。而對于MEM培養液、小牛血清和消化液等需用G5或G6濾器負壓抽濾后使用。 3、無菌操作過程在無菌操作過程中，**重要的是要保持工作區的無菌、清潔。因此，在操作前20～30分鐘要先啟動
超凈臺和紫外燈，并認真洗手和消毒。在操作時，嚴禁喧嘩，嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的止血鉗、鑷子等。培養瓶應在
超凈臺內操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復用酒精燈燒。對于吸管應先用手拿后1/3處，戴上膠皮乳頭，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。 4、常用清潔液的配制法⑴重鉻酸鉀清潔液：可根據不同需要，選用下列的任何一種濃度。先將重鉻酸鉀溶于水中，再慢慢加入濃硫酸。注意，此#p#分頁標題#e#
時可產生高熱，應防止容器破裂。重鉻酸鉀清潔液除污力強，腐蝕性大，應避免接觸皮膚和衣服。為防止吸收空氣的水分而變質，此液應貯存于帶蓋的容器中。如清潔效力較差，可再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸，還可繼續使用。直到液體變藍綠色，即不能再用。配制重鉻酸鉀清潔液時，宜用耐高溫的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿時，應特別注意防止產生高熱而破裂，切忌用量筒來配制。 ⑵磷酸三鈉將其配成5%～10%水溶液，可用于洗滌玻璃器皿上的油污，但經常使用腐蝕玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。 ⑶硝酸清潔液將其配成50%水溶液，可用于清潔微量滴定筒。⑷乙二胺四乙酸二鈉（EDTA鈉鹽）將其配成5%～10%水溶液，可洗脫粘附于玻璃器皿內壁的白色沉淀物。⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白質的良好溶劑，適用于洗滌粘附有血液血清等蛋白質的吸管、試管等。
無菌操作法
2007-10-24 17:23 【大 中 小】【我要糾錯】 無菌操作法，是整個過程控制在無菌條件下進行的一種操作方法。某些藥品加熱滅菌后發生變質、變色或降低含量者可采用無菌操作法制備。此種無菌操作，不僅用于注射劑而且對其它的如滴眼劑、海棉劑等用于粘膜和創傷的制劑也均適用。無菌操作室或無菌操作所用的一切用具、材料以及環境，均須應用面所述滅菌法滅菌，操作須在無菌操作室或無操作柜內進行。
（一）無菌操作的空氣滅菌可應用上節《氣體滅菌法》中所述的甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具體用法不再贅述。藥廠大型無菌操作，常用甲醛溶液加熱熏蒸進行空氣滅菌。將甲醛溶液放入瓶內，逐漸被吸收蒸氣夾層加熱鍋中，甲醛溶液被加熱，甲醛蒸氣經氣出口送入總進風道，由鼓風機吹入無菌操作室，連續3小時后，一般即可將鼓風機關閉。室溫應保持25℃以上，以免室溫過低甲醛蒸氯了聚合而附著于冷表面，濕度應保持60％以上，密閉熏蒸12－24小時以后，再將25％氨水加熱（每m3用8－10ml），從總風道送入氨氣約15分鐘，以吸收甲醛蒸氣，然后開啟總出口排風，并通入經處理過的無菌空氣直到室內無臭氣為止。 除用上述方法定期進行較徹底的滅菌外，還要對室內的空間、用具（桌椅等）、地面、墻壁等，用3％酚溶液、2％煤酚皂溶液、0.2%新潔而或75％酒精噴灑或擦試。其它用具盡量用熱壓滅菌法或干熱滅菌法滅菌。每天工作前開啟外線一小時，中午休息時間也要開1／2－1小時。
（二）無菌操作操作人員進入操作之前要洗澡并換上已經滅菌的工作服和清潔的鞋子，不使頭發、內衣等露出來，以免造成污染機會。安瓿要150－180℃2－3小時干熱滅菌。橡皮塞要以121℃1小時熱壓滅菌。有關器具、機器都要經過滅菌。用無菌操作法制備的注射劑， 大多要加入抑制。醫學教育網搜集整理 小量無菌制劑的制備，也可在無菌操作柜中進行。無菌操作柜分小型無菌操作與聯合無菌無操作兩種小型無菌操作柜又稱單人無菌柜。式樣有單面式與雙面式兩種。操作柜的架子用木制，四周配以玻璃，前面操作下裝木板，挖二圓孔，孔內密接橡皮手套或袖套。藥品及用具等，由側門送入柜內后關閉。操作時可完全與外界空氣隔jue。柜內空氣的滅菌，可在柜中央上方裝一小型紫外線燈，使用前1小時啟燈滅菌，或用藥液（如3％酚溶液）噴霧滅菌。聯合無菌操作柜是由幾個小型操作柜聯合制成，以使原料的精制，傳遞分裝及成品暫時存放等工作全部在柜內進行。近年來，采用層流
潔凈工作臺作無菌操作，使用方便，效果可靠。
意義
無菌是指在環境中一切有生命活動的微生物的營養細胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態。在微生物實驗中， 操作的目的在于防止待接種細菌被雜菌污染。只有在培養基、實驗器皿等處于無菌的前提下，才能保證菌種不被污染。 接種細菌時，應注意以下幾項：
（1）在超凈工作臺上操作，工作臺在使用前要紫外消毒，酒精消毒等 （2）應在酒精燈火焰前操作
（3) 取菌種前灼燒接種針或接種環（要燒紅）
（4）燒紅的接種針（環）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種 （5）接種后應盡快塞上棉塞
總之，一句話，盡可能防止雜菌污染！！！！
